1. ОТБОР И ПОДГОТОВКА ПРОБ
2. АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ И РЕАКТИВЫ
Для проведения испытания применяют аппаратуру, материалы и реактивы по ГОСТ 10444.1 со следующими дополнениями:
* С 1 июля 2002 г. введен в действие ГОСТ 24104-2001. На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 53228-2008.
весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104, с наибольшим пределом взвешивания до 1 кг и пределом допускаемой погрешности ±10 мг (для взвешивания продукта);
микроскоп световой биологический или импортный с аналогичными техническими характеристиками;
термостат с диапазоном рабочих температур от 28 до 55 °С, позволяющий поддерживать заданную температуру с погрешностью ±1 °С;
стерилизатор горячим воздухом;
метил бутанол (амиловый спирт);
натрий аммония фосфат;
полимиксин В сульфат во флаконах по 25 мг (250000 ЕД и по 50 мг (500000 ЕД);
полимиксин М сульфат во флаконах по 500000 ЕД;
желчь сухая или желчь натуральная крупного рогатого скота;
3. ПОДГОТОВКА К ИСПЫТАНИЮ
3.1. Приготовление растворов
3.1.1. Спиртовой раствор массовой концентрацией бромтимолового синего 16 г/дм 3 : 1,6 г бромтимолового синего переносят в мерную колбу вместимостью 100 см 3 и растворяют в этиловом спирте с массовой долей 96 %. Раствор доливают этиловым спиртом до метки.
3.1.9. Растворы полимиксин В сульфата или полимиксин М сульфата готовят непосредственно перед использованием, для этого во флакон со стерильным антибиотиком вносят 5 или 10 см 3 стерильной дистиллированной воды.
3.1.10. Реактивы для определения индола:
Реактивы хранят в сосудах из темного стекла при температуре (4 ± 2) °С не более 1 мес.
3.1.11. Вазелиновое масло готовят по ГОСТ 10444.1.
3.1.12. Спиртовой раствор массовой концентрацией бромкрезолового пурпурного 10 г/дм 3 : 1 г бромкрезолового пурпурного переносят в мерную колбу вместимостью 100 см 3 и растворяют в этиловом спирте с массовой долей 96 %. Раствор доливают этиловым спиртом до метки.
3.2. Приготовление питательных сред
3.2.1. Агар мясо-пептонный готовят по ГОСТ 10444.1.
3.2.2. Бульон мясо-пептонный готовят по ГОСТ 10444.1.
3.2.3. Среда жидкая селективная. Основа среды: к 1 дм 3 мясо-пептонного бульона по п. 3.2.2 добавляют 1,0 г маннита, 50,0 см 3 натуральной бычьей желчи или эквивалентное количество сухой желчи, 0,8 г калия фосфорнокислого двузамещенного, 2,0 см 3 раствора кристаллического фиолетового, приготовленного по п. 3.1.6, 2,0 см 3 спиртового раствора бромтимолового синего, приготовленного по п. 3.1.1. Устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял (6,9 ± 0,1) при 25 °С. Стерилизуют текучим паром при 100 °С в течение 15 мин.
3.2.4. Агар дезоксихолат-цитрат лактозный по Leifson модификация Hynes.
Допускается использовать вместо 1 дм 3 мясной воды и 5,0 г пептона 1 дм 3 мясо-пептонного бульона, приготовленного по п. 3.2.2.
3.2.5. Агар тройной сахарный с цитратом железа: в 1 дм 3 мясо-пептонного бульона по п. 3.2.2 растворяют при нагревании 15 см 3 дрожжевого экстракта, 10,0 г пептона, 10,0 г лактозы, 10,0 г сахарозы, 1,0 г глюкозы, 0,3 г железа (III) цитрата, 0,3 г натрия тиосульфата, 0,024 г фенолового красного, 15,0 г агара. Устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25 °С (7,4 ± 0,1). Разливают в пробирки и стерилизуют при (121 ± 1) °С в течение 10 мин, дают застыть в наклонном положении, чтобы максимальная высота столбика составляла 2,5 см. Среда имеет коричнево-красную окраску. Хранят при комнатной температуре не более 7 сут.
3.2.6. Среда для расщепления фенилаланина: 15 см 3 дрожжевого экстракта, 2,0 г DL-фенилаланина или 1,0 г L-фенилаланина, 1,0 г натрия фосфорнокислого двузамещенного, 5,0 г натрия хлорида, 12,0 г агара растворяют в 1 дм 3 кипящей дистиллированной воды. По 5 см 3 среды разливают в пробирки, стерилизуют при (121 ± 1) °С 10 мин, дают застыть в наклонном положении. Среду хранят при (4 ± 2) °С не более 7 сут.
3.2.7. Агар с цитратом: 0,2 г магния сульфата, 1,0 г однозамещенного фосфорнокислого аммония, 1.0 г натрия аммония фосфата, 2,0 г трехосновного натрия лимоннокислого, 5,0 г натрия хлорида, 0,08 г бромтимолового синего, 15,0 г агара растворяют в 1 дм 3 кипящей дистиллированной воды. Устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25 °С (7,0 ± 0,1). Стерилизуют при (121 ± 1) °С в течение 15 мин и дают застыть в пробирках в наклонном положении. Среда имеет зеленую окраску, ее хранят при комнатной температуре не более 7 сут.
3.2.8. Агар дифференциально-диагностический: к 1 дм 3 расплавленного мясо-пептонного агара по п. 3.2.1 добавляют 15,0 см 3 дрожжевого экстракта, 10,0 г маннита, 10,0 г мальтозы, 80,0 см 3 натуральной бычьей желчи или эквивалентное количество сухой желчи, 2,0 г железа (III) цитрата, 0,5 г натрия тиосульфата, 0,5 см 3 раствора кристаллического фиолетового, приготовленного по п. 3.1.6, 2,0 см 3 щелочного раствора фенолового красного, приготовленного по п. 3.1.3, раствор антибиотика, приготовленного по п. 3.1.9 и содержащего 120000 ЕД полимиксина M сульфата или 100000 ЕД полимиксин B сульфата. Среду стерилизуют текучим паром (при 100 °С) в течение 15 мин и разливают по ГОСТ 26670 после охлаждения по стерильным чашкам Петри. Среду хранят при (4 ± 2) °С не более 7 сут. Готовая среда оранжево-красного цвета.
3.2.9. Триптон-триптофановая среда (Ljutov): 10,0 г триптона или пептона, 5,0 г натрия хлорида, 1,0 г DL-триптофана или 0,5 г L-триптофана растворяют в 1 дм 3 кипящей дистиллированной воды и фильтруют, устанавливают pH так, чтобы после стерилизации он составлял при 25 °С (7,5 ± 0,1). Среду разливают по 5 см 3 в пробирки, стерилизуют при (121 ± 1) °С в течение 15 мин. Среду используют в день приготовления.
3.2.10. Среда для определения декарбоксилазы орнитина:
в 1 дм 3 дистиллированной воды растворяют при нагревании 5,0 г L-орнитина или 10,0 г DL-орнитина, 15,0 см 3 дрожжевого экстракта, 1,0 г глюкозы, 1,2 см 3 раствора бромкрезолового пурпурного, приготовленного по п. 3.1.12. Устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25 °С (6,8 ± 0,1). Среду разливают в пробирки по 5 см 3 и стерилизуют при (121 ± 1) °С в течение 10 мин. Хранят при (4 ± 2) °С не более 7 сут. Готовая среда светло-фиолетового цвета.
4. ПРОВЕДЕНИЕ ИСПЫТАНИЯ
4.1. Из навески продукта готовят исходное и ряд десятикратных разведений по ГОСТ 26669 так, чтобы можно было определить предполагаемое минимальное количество продукта, содержащее бактерии родов Proteus и (или) Morganella, и (или) Providencia или видов Proteus vulgaris или Proteus mirabilis.
4.2. Из продукта и (или) соответствующих разведений высевают по 1,0 см 3 в жидкую селективную среду по п. 3.2.3. Посевы инкубируют при (36 ± 1) °С в течение 48 ч.
4.3. Положительными считают пробирки, в которых наблюдается помутнение среды. При росте бактерий, расщепляющих мочевину, наблюдается изменение цвета среды в синий. Отсутствие изменения цвета среды не является показателем отсутствия роста выявляемых бактерий.
4.4. Для подтверждения присутствия бактерий родов Proteus и (или) Morganella, и (или) Providencia или видов Proteus vulgaris или Proteus mirabilis из всех пробирок, в которых наблюдается помутнение среды, делают пересевы на одну из дифференциально-диагностических плотных сред, приготовленных по п. 3.2.4 или по п. 3.2.8, таким образом, чтобы получить рост изолированных колоний.
Посевы инкубируют при (36 ± 1) °С в течение 48 ч.
4.6. Из всех чашек с характерным ростом выбирают не менее 5 колоний для выделения чистых культур и дальнейшего изучения.
Для получения чистых культур используют скошенный в пробирке мясо-пептонный агар по п. 3.2.1 или мясо-пептонный бульон по п. 3.2.2. Посевы инкубируют при (36 ± 1) °С в течение 24 ч.
4.7. Биохимическое подтверждение принадлежности выделенных микроорганизмов к бактериям родов Proteus и (или) Morganella, и (или) Providencia.
Бактерии родов Proteus, Morganella, Providencia дают положительную реакцию.
4.7.2. Для определения способности образовывать сероводород культуры по п. 4.6 высевают методом укола в столбик и штрихами по поверхности агаризованной среды, приготовленной по п. 3.2.5.
Посевы инкубируют при (36 ± 1) °С в течение 48 ч. При образовании сероводорода столбик среды чернеет. Бактерии рода Proteus образуют сероводород, при этом в столбике среды появляется газ, что указывает на ферментацию глюкозы с образованием кислоты и газа.
Бактерии рода Providencia утилизируют цитрат, бактерии рода Morganella не утилизируют цитрат.
4.8. Для дифференцирования видов P.vulgaris и P.mirabilis у культур, образующих сероводород по п. 4.7.2, проводят определение наличия декарбоксилазы орнитина и способности образовывать индол.
4.8.1. Для определения способности образовывать индол выделенные культуры высевают в триптон-триптофановую среду, приготовленную по п. 3.2.9. Посевы инкубируют при (36 ± 1) °С в течение 48 ч. После инкубирования добавляют 1 см 3 реактива Ковача или Эрлиха, приготовленных по п. 3.1.10. Темно-красное кольцо свидетельствует о положительной реакции.
P.vulgaris образует индол, P.mirabilis и P.myxofaciens индола не образуют.
4.8.2. Для определения наличия декарбоксилазы орнитина выделенные культуры высевают в среду, приготовленную по п. 3.2.10. Посевы инкубируют при (36 ± 1) °С в течение 48 ч. Положительной реакцией считают помутнение среды и изменение ее цвета в фиолетовый.
5. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ
5.1. Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.
5.2. Если при изучении культуральных и биохимических свойств обнаружены микроорганизмы, дезаминирующие фенилаланин, то их относят к бактериям родов Proteus, Morganella, Providencia.
5.2.1. Результаты испытания записывают следующим образом: фенилдезаминирующие бактерии родов Proteus, Morganella, Providencia обнаружены или не обнаружены.
5.3. Если при изучении культуральных и биохимических свойств обнаружены микроорганизмы, дезаминирующие фенилаланин и образующие сероводород, то их относят к бактериям рода Proteus.
Микроорганизмы, дезаминирующие фенилаланин, не образующие сероводород, утилизирующие цитрат, относят к бактериям рода Providencia.
Микроорганизмы, дезаминирующие фенилаланин, не образующие сероводород, не утилизирующие цитрат, относят к бактериям рода Morganella.
5.3.1. Результаты испытания записывают следующим образом: бактерии родов Proteus и (или) Morganella и (или) Providencia обнаружены или не обнаружены.
5.4. Если при изучении культуральных и биохимических свойств обнаружены микроорганизмы, дезаминирующие фенилаланин, образующие сероводород и индол, не декарбоксилизирующие орнитин, то их относят к бактериям вида P.vulgaris.
Если при изучении культуральных и биохимических свойств обнаружены микроорганизмы, дезаминирующие фенилаланин, образующие сероводород, не образующие индол, декарбоксилирующие орнитин, то их относят к бактериям вида P.mirabilis.
5.4.1. Результаты испытания записывают следующим образом:
бактерии видов P.vulgaris и (или) P.mirabilis обнаружены или не обнаружены.
5.5. При записи результатов испытания указывают навеску продукта, в котором обнаружены или не обнаружены выявляемые микроорганизмы.
1. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Всесоюзным научно-исследовательским институтом консервной и овощесушильной промышленности
2. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР по управлению качеством продукции и стандартам от 24.05.90 № 1277
4. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ
Селективная среда для определения бактерий родов proteus morganella providencia
Метод выявления бактерий родов Proteus, Morganella, Providencia
Food products. Method for detection of bacteria of Proteus, Morganella, Providencia genera
Дата введения 1991-07-01
1. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Всесоюзным научно-исследовательским институтом консервной и овощесушильной промышленности
2. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР по управлению качеством продукции и стандартам от 24.05.90 N 1277
4. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ
Обозначение НТД, на который дана ссылка
Номер раздела, пункта
5. Ограничение срока действия снято по протоколу N 5-94 Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации (ИУС 11-12-94)
6. ПЕРЕИЗДАНИЕ. Апрель 2010 г.
Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает метод выявления бактерий родов Proteus, Morganella, Providencia.
Метод основан на высеве определенного количества продукта или его разведений в жидкую селективную среду, культивировании посевов при (36±1) °С в течение 48 ч, последующем пересеве выросших культур на плотные дифференциально-диагностические среды, культивировании посевов при (36±1) °С в течение 48 ч, выделении характерных колоний и подтверждении с помощью биохимических тестов их принадлежности к бактериям родов Proteus и (или) Morganella и (или) Providencia или к видам Proteus vulgaris или Proteus mirabilis.
1. ОТБОР И ПОДГОТОВКА ПРОБ
2. АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ И РЕАКТИВЫ
Для проведения испытания применяют аппаратуру, материалы и реактивы по ГОСТ 10444.1 со следующими дополнениями:
весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104*, с наибольшим пределом взвешивания до 200 г и пределом допускаемой погрешности ±2 мг (для взвешивания реактивов);
* С 1 июля 2002 г. введен в действие ГОСТ 24104-2001. На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 53228-2008.
весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104, с наибольшим пределом взвешивания до 1 кг и пределом допускаемой погрешности ±10 мг (для взвешивания продукта);
микроскоп световой биологический или импортный с аналогичными техническими характеристиками;
термостат с диапазоном рабочих температур от 28 до 55 °С, позволяющий поддерживать заданную температуру с погрешностью ±1 °С;
стерилизатор горячим воздухом;
метил бутанол (амиловый спирт);
натрия тиосульфат (Na S O 5H O);
натрий аммония фосфат;
полимиксин В сульфат во флаконах по 25 мг (250000 ЕД) и по 50 мг (500000 ЕД);
полимиксин М сульфат во флаконах по 500000 ЕД;
L- или DL-фенилаланин;
желчь сухая или желчь натуральная крупного рогатого скота;
железо хлорное (FeCl 6H O)
3. ПОДГОТОВКА К ИСПЫТАНИЮ
3.1. Приготовление растворов
3.1.1. Спиртовой раствор массовой концентрацией бромтимолового синего 16 г/дм : 1,6 г бромтимолового синего переносят в мерную колбу вместимостью 100 см и растворяют в этиловом спирте с массовой долей 96%. Раствор доливают этиловым спиртом до метки.
3.1.9. Растворы полимиксин В сульфата или полимиксин М сульфата готовят непосредственно перед использованием, для этого во флакон со стерильным антибиотиком вносят 5 или 10 см стерильной дистиллированной воды.
3.1.10. Реактивы для определения индола:
Реактив Ковача: 5,0 г парадиметиламинобензальдегида растворяют в 75 см метил бутанола и добавляют 25 см концентрированной соляной кислоты ( =1,18-1,19 г/см ).
Реактив Эрлиха: 4,0 г парадиметиламинобензальдегида растворяют в 380 см этилового спирта с массовой долей 96% и добавляют 80 см концентрированной соляной кислоты ( =1,18-1,19 г/см ).
Реактивы хранят в сосудах из темного стекла при температуре (4±2) °C не более 1 мес.
3.1.11. Вазелиновое масло готовят по ГОСТ 10444.1.
3.1.12. Спиртовой раствор массовой концентрацией бромкрезолового пурпурного 10 г/дм : 1 г бромкрезолового пурпурного переносят в мерную колбу вместимостью 100 см и растворяют в этиловом спирте с массовой долей 96%. Раствор доливают этиловым спиртом до метки.
3.2. Приготовление питательных сред
3.2.1. Агар мясо-пептонный готовят по ГОСТ 10444.1.
3.2.2. Бульон мясо-пептонный готовят по ГОСТ 10444.1.
3.2.3. Среда жидкая селективная. Основа среды: к 1 дм мясо-пептонного бульона по п.3.2.2 добавляют 1,0 г маннита, 50,0 см натуральной бычьей желчи или эквивалентное количество сухой желчи, 0,8 г калия фосфорнокислого двузамещенного, 2,0 см раствора кристаллического фиолетового, приготовленного по п.3.1.6, 2,0 см спиртового раствора бромтимолового синего, приготовленного по п.3.1.1. Устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации он составлял (6,9±0,1) при 25 °С. Стерилизуют текучим паром при 100 °С в течение 15 мин.
3.2.4. Агар дезоксихолат-цитрат лактозный по Leifson модификация Hynes.
Основа среды: в 1 дм кипящей мясной воды, приготовленной по ГОСТ 10444.1, растворяют 5,0 г пептона, 10,0 г лактозы, 22,5 г агара, охлаждают до (45-50) °С, устанавливают рН таким образом, чтобы при 25 °С он составлял (7,4±0,1). Прибавляют 0,03 г нейтрального красного, разливают в мерные колбы, стерилизуют при (115±1) °С в течение 20 мин. Хранят при (4±2) °С не более 7 сут.
Допускается использовать вместо 1 дм мясной воды и 5,0 г пептона 1 дм мясо-пептонного бульона, приготовленного по п.3.2.2.
Proteus spp. (качественный метод)
Описание исследования
Proteus spp. – это род грамотрицательный факультативных анаэробных не образующих спор бактерий, представляющих нормальную, условно-патогенную флору кишечника. Патогенными для человека являются три вида протей – Proteus mirabilis, Proteus vulgaris и Proteus penneri, причем наиболее часто заболевания вызывает Proteus mirabilis.
Протеи похожи на мелкие нитевидные палочки, которые очень активно двигаются. Патогенное действие бактерий объясняется способностью вырабатывать эндотоксин и разрушать красные клетки крови (эритроциты). Кроме того, протеи обладают способностью вырабатывать уреазу – фермент, разлагающий мочевину (уреаза продуцируется также Хеликобактер пилори, что, при заселении протеями верхних отделов желудочно-кишечного тракта, может стать причиной ложноположительного результата при обследовании на инфицирование Helicobacter pylori). В результате реакции выделяется аммиак, способствующий образованию в почках фосфатных камней, микрогнойников, вызывающий некроз (отмирание) почечных тканей, снижение местного иммунитета. Поражение протеями происходит только в случае выхода бактерий за пределы нормальной среды обитания (желудочно-кишечного тракта). Они провоцируют развитие острых кишечных инфекций, которые протекают в форме:
Характерными признаками кишечных инфекций являются следующие симптомы:
Чаще всего кишечные инфекции развиваются у маленьких детей с пониженным иммунитетом. Также заболевание может возникнуть при бесконтрольном приеме антибиотиков.
Поражение протеем урогенитальных путей и почек может привести к развитию:
Кроме вышеперечисленного, Proteus spp. может стать причиной:
Заражение инфекцией может произойти:
Количество протей является показателем санитарного состояния среды. Наличие Proteus mirabilis рассматривают как показатель фекального загрязнения, а Proteus vulgaris —загрязнения объекта органическими веществами.
Данное исследование проводится методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. В рамках теста исследуется соскоб эпителиальных клеток урогенитального тракта, задней стенки глотки, сперма, моча.
Подготовка к исследованию
Соскоб урогенитальный (цервикальный канал, влагалище, уретра)
Соскобы у женщин отбираются не ранее пятого дня от начала менструального цикла и не позже пятого дня до предполагаемой даты следующей менструации. Если наблюдаются явные признаки заболевания, отбор пробы проводится непосредственно в день обращения.
Требования по подготовке к тестированию:
Проба не отбирается:
Мочеиспускательный канал (уретра)
У лиц обоего пола проба отбирается не ранее чем через 14 дней после применения антибиотиков местного действия и 30 дней после перорального приема противобактериальных средств.
За неделю до манипуляции рекомендуется прекратить прием всех медицинских препаратов. Если отказ от лечения невозможен, то пациенту необходимо поставить об этом в известность специалиста, направляющего его на обследование.
При отборе эпителиальных клеток из мочеиспускательного канала, манипуляция проводится перед мочеиспусканием или через 2-3 часа после него (при обильных выделениях из уретры у мужчин – через 1 час).
Соскоб с задней стенки глотки
Перед отбором биологического материала необходимо учесть следующее:
При подготовке к взятию соскоба:
Перед проведением соскоба необходимо прополоскать рот, используя для этого воду комнатной температуры.
Для получения корректного результата тестирования все эти условия необходимо соблюсти в точности. Лечащий врач может рекомендовать иные условия проведения обследования.
Сперма
Отбор материала с целью диагностики проводится до начала противобактериального, антивирусного и противопаразитарного лечения, химиотерапии, а также до лечебных или диагностических мероприятий в месте предполагаемой локализации агента инфекции. После курса лечения проба отбирается не ранее, чем через 10-14 дней при проведении локальной терапии и через 30 дней после перорального приема антибиотиков.
На анализ собирается порция первой утренней мочи, выделенной не ранее, чем через 2-3 часа после предыдущего (ночного) мочеиспускания. Ее объем должен составлять порядка 20-30 мл. Емкость, используемая для сбора биоматериала – стерильный медицинский контейнер.
Моча собирается либо до проведения химиотерапии или лечения антибиотиками, либо через месяц после окончания курса лечения.
Перед началом манипуляции необходимо тщательно обмыть гениталии. Женщинам желательно воспользоваться гигиеническим тампоном во избежание попадания в пробу слизи из влагалища. Во время менструации материал не собирается.
После наполнения контейнера на треть-половину объема, емкость с мочой плотно закрывается крышкой, дабы избежать ее вытекания.
Доставка биоматериала должна быть организована в течение максимум 6 часов. До отправки в лабораторию моча может храниться как в холодильнике (при t⁰ от +2⁰С – замораживать ее нельзя), так и в комнате, но при этом температура не должна быть выше +25⁰С.
Показания к исследованию
Интерпретация исследования
Данный тест – качественный, результат выдается в формулировках «обнаружено» или «не обнаружено».
Нормой является отсутствие в исследуемой пробе специфических фрагментов ДНК Proteus spp.
Результат анализа выдается на бланке лаборатории медицинской компании «Наука». Пример результата по данному анализу представлен ниже:
Ф.И.О.: Иванов Иван Иванович Пол: м Год рождения: 01.01.0000
Дата исследования: 12.12.0000
ГОСТ 28560-90
Продукты пищевые. Метод выявления бактерий родов Рrоtеus, Morganella, Providencia
Купить ГОСТ 28560-90 — бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее
Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО «ЦНТИ Нормоконтроль»
Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.
Способы доставки
Распространяется на пищевые продукты и устанавливает метод выявления бактерий родов Proteus, Morganella, Providencia.
Переиздание. Апрель 2010 г.
Оглавление
1 Отбор и подготовка проб
2 Аппаратура, материалы и реактивы
3 Подготовка к испытанию
3.1 Приготовление растворов
3.2 Приготовление питательных сред
4 Проведение испытания
5 Обработка результатов
| Дата введения | 01.07.1991 |
|---|---|
| Добавлен в базу | 01.09.2013 |
| Актуализация | 01.02.2020 |
Этот ГОСТ находится в:
Организации:
| 24.05.1990 | Утвержден | Государственный комитет СССР по управлению качеством продукции и стандартам | 1277 |
|---|---|---|---|
| Разработан | ВНИИ консервной и овощесушильной промышленности | ||
| Издан | Издательство стандартов | 1990 г. | |
| Издан | Стандартинформ | 2005 г. | |
| Издан | Стандартинформ | 2010 г. |
Food products. Method for detection of bacteria of Proteus, Morganella, Providencia genera
Чтобы бесплатно скачать этот документ в формате PDF, поддержите наш сайт и нажмите кнопку:
ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ
МЕТОД ВЫЯВЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ РОДОВ PROTEUS, MORGANELLA, PROVIDENC1A
И здание официальное
УДК 663/.664.001.4:006.354 Группа Н09
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ
Метод выявления бактерий родов Proteus, Morganella, Providcncia
Food products. Method for detection of bacteria of Proteus. Morganella. Providcncia genera
MKC 07.100.30 ОКСТУ 9109
Дата введения 01.07.91
Настоящий стандарт распространяется на пишеные продукты и устанавливает метод выявлении бактерий родов Proteus. Morganella. Providencia.
Метод основан на высеве определенного количества продукта или его разведений в жидкую селективную среду, культивировании посевов при (36 ± 1) ’С в течение 48 ч. последующем пересеве выросших культур на плотные дифференциально-диагностические среды, культивировании посевов при (36 ± I) ‘С в течение 48 ч. выделении характерных колоний и подтверждении с помощью биохимических тестов их принадлежности к бактериям родов Proteus и (или) Morganella и (или) Providencia или к видам Proteus vulgaris или Proteus mirabilis.
I. ОТБОР И ПОДГОТОВКА ПРОБ
Отбор проб — по ГОСТ 26668. подготовка к испытанию — по ГОСТ 26669.
2. АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ И РЕАКТИВЫ
Для проведения испытания применяют аппаратуру, материалы и реактивы по ГОСТ 10444.1 со следующими дополнениями:
весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104*, с наибольшим предедом взвешивания до 200 г и пределом допускаемой погрешности ± 2 мг (для взвешивания реактивов);
весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104, с наибольшим пределом взвешивания до I кг и пределом допускаемой погрешности ± 10 мг (для взвешивания продукта);
микроскоп световой биологический или импортный с аналогичными техническими характеристиками;
термостат с диапазоном рабочих температур от 28 до 55 *С. позволяющий поддерживать заданную температуру с погрешностью ±1 *С; холодильник бытовой; стерилизатор горячим воздухом; адонит: мальтоза;
метил бутанол (амиловый спирт); мочевина;
И мание официальное ★
• С I июля 2002 г. введен в действие ГОСТ 24104— 2001. На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 53228—200Х.
Перепечатка носи решена
© Издательство стандартов. 1990 © СТАНДАРТИНФОРМ, 2010
нейтральный красный; натрия деэоксихолаг, натрия тиосу;н>фат (NaiSiOySlbO); натрий аммония фосфат:
полимиксин В сульфат во флаконах по 25 мг (250 ООО ЕД и по 50 мг (500 000 ЕД); полимиксин М сульфат во флаконах по 500 000 ЕД;
L — или DL-фенилаланин;
L — или DL-орнитин; феноловый красный;
желчь сухая или желчь натуральная крупного рогатого скота;
железо хлорное (FcCl y6HiO)
3. ПОДГОТОВКА К ИСПЫТАНИЮ
3.1. Приготовление растворов
3.1.1. Спиртовой раствор массовой концентрацией бромтимолового синего 16 г/дм 5 : 1.6 г бром тимолового синего переносят в мерную колбу вместимостью 100 см 5 и растворяют в этиловом спирте с массовой долей % %. Раствор доливают этиловым спиртом до метки.
3.1.2. Раствор массовой концентрацией мочевины 500 г/дм 5 : 50 г мочевины переносят в мерную колбу вместимостью 100 см’, растворяют в дистиллированной воде, раствор доливают до метки.
3.1.3. Щелочной раствор фенолового красного массовой концентрацией 16 г/дм’: 1.6 г фенолового красного растворяют в мерной колбе вместимостью 100 см’ в растворе гидроксида натрия массовой концентрацией 100 г/дм’. Раствор доливают раствором гидроксида натрия до метки.
3.1.5. Раствор гидроксида натрия массовой концентрацией 100 г/дм 3 : 10 г гидроксида натрия переносят в мерную колбу вместимостью 100 см’, растворяют в дистиллированной воде. Раствор долива ют до метки.
3.1.6. Раствор кристаллического фиолетового массовой концентрацией I г/дм’: 0.1 г криста.ыи-ческого фиолетового переносят в мерную колбу вместимостью 100 см’, растворяют в дистиллированной воде. Раствор доливают до метки.
3.1.7. Раствор для среды агара-дезоксихолат-цитрат лактозного: 17.0 г натрия лимоннокислого.
1.0 г натрия тиосульфата, 2.0 г железа (III) цитрата помещают в мерную колбу вместимостью 100 см’, растворяют в дистиллированной воде. Раствор доводят до метки и выдерживают на водяной бане при (60 ± I) *С в течение I ч. Раствор хранят при комнатной температуре не более 3 мес.
3.1.8. Раствор дезоксихолата натрия массовой концентрацией 100 г/дм’: 10 гдезокенхолата натрия переносят в мерную колбу вместимостью 1 (К) см’, растворяют в дистиллированной воде. Раствор доливают до метки и выдерживают на водяной бане при (60 ± 1) *С в течение 1 ч. Раствор хранят при комнатной температуре не более 6 мес.
3.1.9. Растворы полимиксин В сульфата или полимиксин М сульфата готовят непосредственно перед использованием, для этого во флакон со стерильным антибиотиком вносят 5 или 10 см’ стерильной дистиллированной воды.
3.1.10. Реактивы для определения индола:
Реактив Ковача: 5.0 г парадиметилам инобензальдегнда растворяют в 75 см ‘ метил бутанола и добавляют 25 см’ концентрированной соляной кислоты (р = 1,18—1.19 г/см 5 ).
Реактив Эрлиха: 4.0 г парадиметиламинобензальдегида растворяют в 380 см’ этилового спирта с массовой долей 96 % и добавляют 80 см’ концентрированной соляной кислоты (р = 1,18 — 1.19 г/см’). Реактивы хранят в сосудах из темного стекла при температуре (4 ± 2) *С не более 1 мес.
3.1.11. Вазелиновое масло готовят по ГОСТ 10444.1.
3.1.12. Спиртовой раствор массовой концентрацией бромкрезолового пурпурного 10 г/дм 3 : I г бромкрезолового пурпурного переносят в мерную колбу вместимостью 100 см * и растворяют в этиловом спирте с массовой долей 96 %. Раствор доливают этиловым спиртом до метки.
3.2. Приготовление питательных сред
3.2.1. Агар мясо-пептонный готовят по ГОСТ 10444.1.
3.2.2. Бульон мясо-пептонный готовят по ГОСТ 10444.1.
3.2.3. Среда жидкая селективная. Основ;» среды: к 1 дм 3 мясо-неитонного бульона по и. 3.2.2 добавляют 1.0 г маннита. 50.0 см 3 натуральной бычьей желчи или эквивалентное количество сухой желчи. 0.8 г калия фосфорнокислого двузамещенного, 2.0 см 3 раствора кристаллического фиолетового, приготовленного но и. 3.1.6. 2,0 см 3 спиртового раствора бромтиматового синего, приготовленного но п. 3.1.1. Устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял (6.9 ±0.1) при 25 ‘С. Стерилизуют текучим паром при 100 *С в течение 15 мин.
3.2.4. Агар дезоксихолат-цитрат лактозный по Leifson модификация Hynes.
Основа среды: в I дм 1 кипяшей мясной воды, приготовленной по ГОСТ 10444.1. растворяют
5.0 г пептона. 10.0 г лактозы. 22.5 г агара, охлаждают до (45—50) *С. устанавливают pH таким образом, чтобы при 25 *С он составлял (7.4 ± 0.1). Прибавляют 0.03 г нейтрального красного, рахшвают в мерные колбы, стерилизуют при (115 ± 1) ‘С в течение 20 мин. Хранят при (4 ± 2) ‘С не более 7 сут.
Допускается использовать вместо 1 дм 3 мясной воды и 5.0 г пептона 1 дм 3 мясо-пептонного бульона, приготовленного по и. 3.2.2.
Для пригото&тенпя питательной среды к расплавленной и охлажденной до 45—50 *С основе прибавляют из расчета на 100 см 3 основы 5 см 3 раствора солей, приготовленных по и. 3.1.7. и 5 см 3 раствора дезоксихолата натрия, приготовленного по п. 3.1.8. Среду перемешивают и разливают по стерильным чашкам Петри по ГОСТ 26670. Среду используют в день ее приготовления.
3.2.5. Агар тройной сахарный с цитратом железа: в I дм 1 мясо-пептонного бульона по п. 3.2.2 растворяют при нагревании 15 см 1 дрожжевого экстракта, 10,0 г пептона. 10.0 г лактозы. 10.0 г сахарозы. 1,0 г глюкозы. 0.3 г железа (III) цитрата. 0.3 г натрия тиосульфата. 0.024 г фенолового красного. 15.0 гагара. Устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25 *С (7.4 ±0.1). Разливают в пробирки и стерилизуют при (121 ± 1)*Свтсченис 10 мин. дают застыть в наклонном положении, чтобы максимальная высота столбика составляла 2.5 см. Среда имеет коричнево-красную окраску. Хранят при комнатной температуре не более 7 сут.
3.2.6. Среда для расщепления фенилаланина: 15 см 3 дрожжевого экстракта, 2.0 г Ш.-фенилаланина или 1.0 г /.-фенилаланина, 1.0 г натрия фосфорнокислого двузамещенного. 5,0 г натрия хлорида. 12.0 гагара растворяют в 1 дм 3 кипящей дистиллированной воды. По 5 см 3 среды рахшвают в пробирки, стерилизуют при (121 ± 1) *С 10 мин. дают застыть в наклонном положении. Среду хранят при (4 ± 2) ‘С не более 7 сут.
3.2.7. Агар с цитратом: 0.2 г магния сульфата. 1.0 г однохтмешеиного фосфорнокислого аммония,
1.0 г натрия аммония фосфата. 2,0 г трехосновного натрия лимоннокислого, 5,0 г натрия хлорида,
0.08 г бромтимолового синего, 15,0 г агара растворяют в I дм 3 кипящей дистиллированной воды. Устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилихшии он составлял при 25 *С (7.0 ± 0.1). Стерилизуют при (121 ± I) ‘С в течение 15 мин и дают застыть в пробирках в наклонном положении. Среда имеет зеленую окраску, ее хранят при комнатной температуре не батее 7 сут.
3.2.8. Aiap дифференциально-диагностический: к 1 дм 3 расплавленного мясо-пептонного агара по п. 3.2.1 добавляют 15.0 см 1 дрожжевого экстракта. 10,0 г маннита. 10,0 г мальтозы, 80.0 см 3 натурать-ной бычьей желчи или эквива1енгное количество сухой желчи. 2.0 г железа (III) цитрата. 0.5 г натрия тиосульфата, 0.5 см 3 раствора кристаллического фиолетового, приготовленного по п. 3.1.6. 2.0 ем 3 щелочного раствора фенолового красного, приготовленного по п. 3.1.3. раствор антибиотика, приготовленного по н. 3.1.9 и содержащего 120 000 ЕД полимиксина М сульфата или 100 000 ЕД полимик-син В сульфата. Среду стерилизуют текучим паром (при 100 ’С) в течение 15 мин и разливают по ГОСТ 26670 после охлаждения по стерильным чашкам Петри. Среду хранят при (4 ± 2) *С не более 7 сут. Готовая среда оранжево-красного цвета.
3.2.9. Трипгон- гриптофановая среда (Ljutov): 10.0 г тритона или пептона. 5.0 г натрия хлорида,
1.0 г /)/.-триптофана или 0.5 г /.-триптофана растворяют в 1 дм 3 кипящей дистиллированной воды и фильтруют, устанавливают pH так. чтобы после стерилихшии он составлял при 25 ’С (7.5 ±0.1). Среду рахшвают по 5 см 3 в пробирки, стерилизуют при (121 ± 1) *С в течение 15 мин. Среду используют в день приготовления.
3.2.10. Среда для определения декарбоксилазы орнитина:
в I дм 3 дистиллированной воды растворяют при ншреванип 5.0 г /.-орнитина или 10.0 г /)/.-орнитина. 15,0 см 3 дрожжевого экстракта. 1.0 г глюкозы. 1.2 см 3 раствора бром к ре зол о во го пурпурного, приготовленного по и. 3.1.12. Устанавливают pH таким образом, чтобы ноете стерилизации он составлял при 25 *С (6,8 ± 0.1). Среду рахшвают в пробирки но 5 см’ и стерилизуют при (121 ± 1) *С в течение 10 мин. Хранят при (4 ± 2) *С не более 7 сут. Готовая среда светло-фиолетового цвета.
4. ПРОВИДЕНИЕ ИСПЫТАНИЯ
4.1. Из навески продукта готовят исходное и ряд десятикратных разведений по ГОСТ 26669 так, чтобы можно было определить предполагаемое минимальное количество продукта, содержащее бактерии родов Proteus и (или) Morganella. и (или) Providencia или видов Proteus vulgaris или Proteus mirabilis.
4.2. Из продукта и (или) соответствующих разведений высевают по 1.0 см ’ в жидкую селективную среду по и. 3.2.3. Посевы инкубируют при (36 ± 1) °С в течение 48 ч.
4.3. Положительными считают пробирки, в которых наблюдается помутнение среды. При росте бакзерий. расщепляющих мочевину, наблюдается изменение цвета среды в синий. Отсутствие изменения цвета среды не является показателем отсутствия роста выя&шемых бактерий.
4.4. Для подтверждения присутствия бактерий родов Proteus и (или) Morganella. и (или) Providencia или видов Proteus vulgaris или Proteus mirabilis из всех пробирок, в которых наблюдается помугненне среды, делают пересевы на одну из дифференциально-диагностических плотных сред, приготовленных по п. 3.2.4 или но и. 3.2.8. таким образом, чтобы получить рост изолированных колоний.
Посевы инкубируют при (36 ± 1) *С в течение 48 ч.
4.5. На дифференциально-диагностических плотных средах бактерии образуют колонии круглой (]юрмы диаметром 1—3 мм. Бактерии рода Proteus обладают свойовом роения (ползучим ростом).
4.6. Из всех чашек с характерным ростом выбирают не менее 5 колоний дли выделения чистых культур и дальнейшего изучении.
Д|и получения чистых культур используют скошенный в пробирке мисо-петонный агар по п. 3.2.1 или мясо-пептонный бульон по п. 3.2.2. Посевы инкубируют при (36 ± I) *С в течение 24 ч.
4.7. Биохимическое подтверждение принадлежности выделенных микроорганизмов к бактериям родов Proteus и (или) Morganella. и (или) Providencia.
4.7.1. Для определения наличия дезаминазы фенилаланина из 24-часовой культуры но п. 4.6 делают высев штрихами на поверхность скошенного в пробирке агара, приготовленного по п. 3.2.6. и культивируют при (36 ± I) ’С в течение 48 ч. после этого на поверхность агара пипеткой наносят 3—5 капель раствора хлорного железа, приготовленного но п. 3.1.4. При этом появление интенсивной зеленой окраски среды свидетельствует о положительной реакции. При отрицательной реакции цвет среды не меняется.
Бактерии родов Proteus, Morganella. Providencia дают положительную реакцию.
4.7.2. Для определения способности образовывать сероводород культуры по п. 4.6 высевают методом укола в столбик и штрихами по поверхности аглризо ванной среды, приготовленной по п.3.2.5.
Посевы инкубируют при (36 ± I) *С в течение 48 ч. При образовании сероводорода столбик среды чернеет. Бактерии рода Proteus образуют сероводород, при этом в столбике среды появляется газ, что указывает на ферментацию глюкозы с образованием кислоты и газа.
Допускается инкубирование посевов при отсутствии сероводорода через 48 ч продолжать до 4 сут. так как P.niyxofaciens может образовывать сероводород на 3-и — 4-е сутки. Бактерии рода Morganella и Providencia сероводорода не образуют.
4.7.3. Для определения способности утилизировать цитрат культуры, не образующие сероводород по н. 4.7.2, пересевают на поверхность скошенного агара, приготовлеиного но и. 3.2.7. Посевы инкубируют при (36 ± I) ‘С в течение 48 ч. Окрашивание среды в синий цвет — положительная реакция, отсутствие изменения— отрицательная реакция.
Бактерии рода Providencia утилизируют цитрат, бактерии рода Morganella не утилизируют цитрат.
4.8. Для дифференцирования видов P.vulgaris и P.mirabilis у культур, образующих серо!юдород по и. 4.7.2. проводят определение наличия декарбоксилазы орнитнна и способности образовывать индол.
4.8.1. Для определения способности образовывать индол выделенные культуры высевают в триптон-триптофановую среду, приготовленную но и. 3.2.9. Посевы инкубируют при (36 ± 1) ‘С в течение 48 ч. После инкубирования добавляют 1 см’ реактива Ковача или Эрлиха, приготовленных по н. 3.1.10. Темно-красное кольцо свидетельствует о положительной реакции.
P.vulgaris образует индол. P.mirabilis и P.myxofaciens индола не образуют.
4.8.2. Для определения наличия декарбоксилазы орнитнна выделенные культуры высевают в среду, приготовленную по и. 3.2.10. Посевы инкубируют при (36 ± I) *С в течение 48 ч. Положительной реакцией считают помутнение среды и изменение ее цвета в фиолетовый.
P.mirabilis дает положительную реакцию. P.vulgaris P.myxofaciens — отрицательную.
5. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ
5.1. Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.
5.2. Если при изучении культуральных и биохимических свойств обнаружены микроорганизмы, дезаминирующие фенилаланин, то их относят к бактериям родов Proteus. Morganella. Providencia.
5.2.1. Результаты испытания записывают следующим образом: фенилдезаминируюшие бактерии родов Proteus. Morganella. Providencia обнаружены или не обнаружены.
5.3. Если при изучении культуральных и биохимических свойств обнаружены микроорганизмы, дезаминирующие фенилаланин и образующие сероводород, то их относят к бактериям рода Proteus.
Микроорганизмы, дезаминирующие фенилаланин, не образующие сероводород, утилизирующие цитрат, относят к бактериям рода Providencia.
Микроорганизмы, дезаминирующие фенилаланин, не образующие сероводород, не утилизирующие цитрат, относят к бактериям рода Morganella.
5.3.1. Результаты испытания записывают следующим образом: бактерии родов Proteus и (или) Morganella и (или) Providencia обнаружены или не обнаружены.
5.4. Если при изучении культуральных и биохимических свойств обнаружены микроорганизмы, дезаминирующие фенилаланин, образующие сероводород и индол, не декарбоксилизируюшие орни-тин. то их относят к бактериям вида P.vulgaris.
Если при изучении культуральных и биохимических свойств обнаружены микроорганизмы, дезаминирующие фенилаланин, образующие сероводород, не образующие индол, декарбоксилируюшие орнитин. то их относят к бактериям вида P.mirabilis.
5.4.1. Результаты испытания записывают следующим образом:
бактерии видов P.vulgaris и (или) P.mirabilis обнаружены или нс обнаружены.
5.5. При записи результатов испытания указывают навеску продукта, в котором обнаружены или не обнаружены выявляемые микроорганизмы.
ИНФОРМАЦИОННЫ К ДАННЫ К
I. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Всесоюзным научно-исследовательским институтом консервной и овощееушильной промышленное!и
2. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР но управлению качеством продукции и стандартам от 24.05.90 № 1277
4. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУ МЕНТЫ